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비파엽(枇杷葉)과 차엽(茶葉)을 이용한 발효차의 혈당강하 효과

Hypoglycemic Effect of Fermented Tea Made with Leaves from Eriobotrya japonica L. and Camellia sinensis L.

  • 엄효진 (Eom, Hyo-Jin, 동신대학교 대학원)

초록/요약

지역 특화자원의 고부가가치 소재화를 위한 연구의 일환으로 비파엽과 차엽을 이용한 신개념 발효차를 제조하여 기능성 소재로서의 이용 가능성을 검토하였다. 대사성질환으로 잘 알려진 제2형 당뇨병의 발병은 비만과 높은 상관관계를 가지고 있으므로 당뇨의 치료와 예방을 위해서는 근본적으로 비만 예방에 대한 접근이 필요하며, 탄수화물 소화관련 효소의 작용을 저해함으로써 식후 혈당 상승을 억제시키는 동시에 산화적 스트레스에 대한 방어 능력 향상이 당뇨 합병증 발병을 감소시킬 수 있으므로, 천연자원으로부터 당뇨병치료와 예방에 효과적인 기능성 소재를 발굴하고자 비파엽과 차엽을 혼합한 발효차의 생리활성 및 유효성분을 분석하였다. 발효차는 비파엽 발효차(L), 차엽 발효차(G), 비파엽과 차엽 혼합발효차(LG)로 구분하여 발효 전 열처리 조건(L-P, G-P, LG-P) 및 발효시간에 따른 생리활성의 차이를 조사하였다. 그 결과 페놀성 화합물 함량은 12시간 발효한 G-P 339.8㎎/g, LG-P 247.2㎎/g 순으로 높게 나타났고, 플라보노이드 함량도 12시간 발효한 G-P(163.8㎎/g)와 LG-P(122.9㎎/g)순으로 높게 나타나 발효 전 열처리하여 12시간 발효시킨 것이 이들 화합물의 함량을 높이는데 기여하는 것으로 판단되었다. DPPH radical 소거능은 총 페놀과 플라보노이드 함량에 비례하여 12시간 발효조건의 G-P가 IC50 0.296㎎/㎖로 최고 활성을 보였고, LG-P(IC50 0.419㎎/㎖)가 그 뒤를 이었다. 비 발효차와 비교하였을 때 발효차의 항산화활성이 약 20% 증가하였으며, 이러한 발효 전 열처리는 체내에 발생하는 활성 산소종을 효과적으로 제거할 수 있을 것으로 사료된다. 그러나 SOD 유사활성과 NO소거능은 발효시간이나 발효 전 열처리에 따른 유의차가 크게 나타나지 않았다. α-Amylase 활성 저해율은 G-P가 6∼12시간 발효조건에서 가장 높은 활성을 나타냈고, LG-P도 12시간 발효한 것이 G-P와 유사한 활성을 보여 발효 전 열처리 조건에 의해 두 시료 모두 2배 이상 활성이 증가되었다. α-Glucosidase 활성 저해율은 모든 시료가 양성대조군인 acarbose의 1/10 농도 수준에서 acarbose보다 높은 활성을 보였으며 각 시료별 유의차는 크게 나타나지 않았다. 한편, 열처리 후 12시간 발효한 시료를 전구지방세포인 3T3-L1 세포에 처리한 결과 LG-P가 O.D값 0.070으로 지방세포 분화를 가장 억제시켰으며, 전사인자 C/EBPα 발현 억제효과도 LG-P > G-P > L-P 순으로 나타났다. 이는 비파엽과 차엽을 이용한 발효차가 지방축적을 억제시켜 비만을 예방하는 기능성 소재로서 충분한 가치를 짐작하게 하였고, 나아가 당뇨병이나 당뇨 합병증을 예방할 수 있는 소재로의 개발 가능성을 시사하는 결과였다. 생리활성 비교 분석 결과 상대적 우위를 보였던 12시간 발효한 L-P, G-P, LG-P 추출물의 용매별 분획을 실시하여 총 페놀 및 플라보노이드 함량이 높게 나타난 ethyl acetate층은 MPLC를 이용하여 2차 분리를 실시하였고, 그 가운데 2개의 sub-fraction(E-1, E-2)에서 항산화활성이 높게 나타났다. 항산화활성이 높은 sub-fraction의 caffeine 및 catechin류 함량 분석 결과, L-P의 sub-fraction E-1은 caffeine 함량이 103.9㎎/g으로 가장 높았고, G-P의 sub-fraction중 E-1은 gallocatechin gallate(GCG)과 epigallocatechin gallate(EGCG)이 각각 255.7㎎/g, 211.0㎎/g이었고, E-2는 epigallocatechin(EGC)이 169.9㎎/g으로 가장 높은 함량을 보였다. LG-P의 sub-fraction E-1은 GCG, EGCG, catechin(C), EGC이 각각 185.9㎎/g, 127.9㎎/g, 113.6㎎/g, 109.6㎎/g으로 다른 발효차에 비해 다양한 화합물이 고르게 함유되어 있음을 알 수 있었다. 이상 비파엽과 차엽을 이용한 발효차 추출물이 산화적 스트레스를 감소시키고 비만을 방지하여 당뇨의 발병이나 합병증의 예방과 치료에 기여할 수 있는 가능성과, α-amylase와 α-glucosidase 효소의 작용을 억제시키는 것을 확인하였다. 따라서 비파엽과 차엽을 이용한 발효차 추출물은 제2형 당뇨병의 예방과 치료에 부작용 우려가 없는 안전한 소재로 활용될 가능성이 높은 것으로 판단되었다. 또한 비파엽과 차엽을 이용한 발효차 추출물에서 분리한 혈당강하 작용물질의 검색과 작용 기전, 특성에 대한 연구가 계속된다면 우수한 천연물 유래 혈당강하 소재 개발이 가능할 것으로 기대된다.

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초록/요약

Postprandial hyperglycemia plays an important role in the development of type 2 diabetes mellitus and complications associated with the disease, such as microvascular and macrovascular disease. The occurrence of type 2 diabetes mellitus, known as metabolic diseases has a high correlation with obesity. In other words, prevention of obesity is needed for the treatment and prevention of diabetes. A rising of postprandial glucose will be controled by the inhibition of enzymes related carbohydrate digestion. And the occurrence of diabetic complications will be reduced by the defense against oxidative stress. In this study, for the excavation of functional material from natural resources to prevention and treatment of diabetes, active compounds analysis and physiological activity measurement of the fermented tea made with leaves from Eriobotrya japonica L. and Camellia sinensis L. were performed. After dividing of tea samples as L(fermented tea of E. japonica leaf only), G(fermented tea of C. sinensis leaf only) and LG(fermented tea of mixture E. japonica and C. sinensis leaf) by using materials, we investigated on a differences of physiological activity according to the condition of heat treatment and the fermented time in extracts of teas. In the content of total phenols, extract of 12-hours fermented G-P and LG-P showed 342.2㎎/g and 247.3㎎/g. Likewise, the flavonoid contents of same conditions showed a higher level of 189.4㎎/g and 132.6㎎/g. In DPPH radical scavenging ability, 12-hours fermented G-P was exhibited the most effective IC50 of 0.296㎎/㎖, and the second effective IC50 was 0.419㎎/㎖ of 12-hours fermented LG-P. Antioxidative activity of fermented tea more than non-fermented tea was increased by 20%. However, SOD-likely activity and NO production effect did not show a statistically significant difference. In the α-amylase inhibition activity, 6-12 hours fermented G-P was the most effective, and a similar activity was exhibited 12-hours fermented LG-P. Inhibition activity of fermented tea with heat treatment was increased by about 2-times than non-heat treatment fermented tea. The result of α-glucosidase inhibition activity in fermented tea extract was exhibited high activity than acarbose used as positive control in 1/10 of concentration level. However, a difference of activities among the every extract was not significant. On the other hand, 12-hours fermented LG-P showed the most strong suppression effects of the differentiation of 3T3-L1 preadipocyte and C/EBPα expression. These results suggest that fermented tea made with leaves from E. japonica and C. sinensis is a functional material with sufficient value to prevent obesity by suppressing fat accumulation. The extract of 12-hours fermented tea(L-P, G-P, LG-P) was fractionted to confirming the inhibition of enzymes related carbohydrate digestion. An ethyl acetate fraction what was showed the most effective activity to carried out the MPLC separation. Sub-fractions(E-1, E-2) of ethyl acetate fraction was exhibited a higher antioxidative activity than other sub -fractions. In the result of an analysis for content determination of caffeine and catechins in sub-fractions showed high antioxidative activity, E-1 sub-fraction of L-P was showed 103.9㎎/㎖ of caffeine as the highest content. E-1 sub-fraction of G-P was found to be as follows GCG(gallocatachin gallate, 255.7㎎/㎖), EGCG(epigallo catechin gallate, 211.0㎎/㎖), and EGC(epigallocatechin, 169.9㎎/㎖)was showed the highest content in E-2 sub-fraction of G-P. Moreover E-1 sub-fraction of LG-P was found to be as follows GCG(185.9㎎/㎖), EGCG(127.9㎎/㎖), C(catechin, 113.6㎎/㎖) and EGC(109.6㎎/㎖) with containing evenly of various compound. In conclusion, fermented tea extract made with leaves from E. japonica and C. sinensis has been confirmed to inhibits the action of α-amylase and α-glucosidase. These results show the possibility to prevent or treat diabetes by reducing oxidative stress and preventing obesity. Therefore, fermented tea extract made with leaves from E. japonica and C. sinensis was determined to be utilized as a safe material for prevention of type 2 diabetes without side effects. Moreover, It was expected that if searching and study for a hypoglycemia compounds in fermented tea extract made with leaves from E. japonica and C. sinensis continues than development of hypoglycemia material originated from natural product would be possible.

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목차

Ⅰ. 서론 1
Ⅱ. 재료 및 방법 5
1. 실험 재료 5
2. 시약 5
3. 세포주 6
4. 실험 방법 7
(1) 발효차 제조 7
(2) 추출 및 건조 8
(3) 페놀성 화합물 및 플라보노이드 정량 8
1) 페놀성 화합물 함량 8
2) 플라보노이드 함량 8
(4) In vitro 항산화활성 측정 10
1) DPPH radical 소거 활성 10
2) Superoxide dismutase(SOD) 유사 활성 10
3) Nitric oxide(NO) 생성 억제 활성 11
(5) 세포생존율 측정(MTT assay) 12
(6) 탄수화물 소화관련 효소작용 저해 활성 측정 13
1) α-Amylase 저해 활성 13
2) α-Glucosidase 저해 활성 14
(7) 지방분해능 측정 15
1) 3T3-L1 지방전구세포의 배양 15
2) 3T3-L1 지방전구세포의 분화 유도 15
3) Oil red O 염색 16
4) Western blotting법에 의한 protein 발현 조사 17
(8) MPLC(Midium pressure liquid chromatography)를 이용한 분획 18
(9) Caffeine과 catechin류 분석 20
(10) 통계처리 21
Ⅲ. 결과 및 고찰 22
1. 페놀성 화합물 및 플라보노이드 함량 22
2. 항산화활성 27
(1) DPPH radical 소거 활성 27
(2) Superoxide dismutase(SOD) 유사 활성 31
(3) Nitric oxide(NO) 생성 억제 활성 33
1) MTT assay에 의한 Raw 264.7 세포생존율 33
2) NO 생성 억제 활성 35
3. α-Amylase와 α-glucosidase 저해 활성 38
4. 지방분해 활성 44
(1) 3T3-L1 지방전구세포의 증식 억제 효과 44
(2) 3T3-L1 지방전구세포의 지방생성 억제 효과 46
(3) C/EBPα의 발현 억제 효과 49
5. 분획물의 생리활성 및 성분 분석 51
(1) 분획물 수율 비교 51
(2) 페놀성 화합물 및 플라보노이드 함량 52
(3) DPPH radical 소거 활성 54
(4) Caffeine과 catechin류 함량 56
6. Caffeine과 catechin류의 α-amylase와 α-glucosidase 저해 활성 60
참고문헌 63
영문초록 74
감사의 글 78

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