토복령이 피부암 세포의 성장에 미치는 영향
Effects of Smilax China L. on the Growth of Skin Cancer Cell
- 주제(키워드) 피부암 , 흑색종 , 토복령추출물 , 항암
- 발행기관 동신대학교 일반대학원
- 지도교수 박수연
- 발행년도 2024
- 학위수여년월 2024. 2
- 학위명 석사
- 학과 및 전공 일반대학원 한의학과
- 원문페이지 53
- 실제URI http://www.dcollection.net/handler/dsu/200000721307
- UCI I804:46001-200000721307
- 본문언어 한국어
- 저작권 동신대학교 논문은 저작권에 의해 보호받습니다.
초록/요약
토복령이 피부암 세포의 성장에 미치는 영향 송 시 열 동신대학교 대학원 한의학과 (지도교수 박수연) 피부암의 치료는 외과적 절제술이 주로 시행되고 보조적으로 방사선 치료와 약물 치료 등이 시행되고 있지만 수술에 대한 환자들의 거부감 그리고 약물과 방사선 치 료의 부작용이 있어 상대적으로 안전한 생약 등의 치료법에 관심이 많아지고 있다. 이에 본 연구는 토복령 에탄올 추출물(SCL-EtOH)이 피부암 세포 성장에 미치는 영향을 관찰하였다. 인간의 정상 세포주인 HaCaT에 SCL-EtOH를 5, 10, 20, 40 ㎍/㎖의 농도로 처리 하여 정상 세포에 대한 독성 여부를 확인한 결과 HaCaT에 대해 최고 농도인 40 ㎍/㎖까지 독성이 없었다. 피부암 세포주인 A431, SK-MEL-5, SK-MEL-28에 대해 서는 시간 및 농도 의존적으로 유의성 있게 세포 성장 억제를 보였다. 또 SCL-EtOH 처리에 따른 피부암 세포의 형태를 확인해 본 결과, 농도의 증가에 따 라 정상적으로 부착하여 성장하는 세포가 줄어들고 세포의 형태가 변화하는 것을 관찰하였다. 한편 쥐의 정상 상피세포주인 JB6 Cl41에 성장인자인 epidermal growth factor(EGF)와 염증인자인 phorbol 12-myristate 13-acetate(TPA)를 처리하여 세포 변형(cell transformation)을 유도하고 SCL-EtOH를 처리하여 세포변형의 억제 효과 를 확인하기 위해 anchorage-independent cell growth 실험을 수행한 결과 EGF 또 는 TPA를 처리한 JB6 Cl41 세포에서 모두 농도 의존적으로 colony의 형성이 유의 성 있게 감소하였다. 또한, SK-MEL-5와 SK-MEL-28 세포에 SCL-EtOH를 다양한 농도로 처리한 후 세포주기에 미치는 영향을 관찰하였다. FxCycle™ PI/RNase Staining Solution으로 염색하고 flow cytometry로 분석한 결과, SCL-EtOH가 G2/M phase를 정지시켰으 며 western blot에서도 관련 마커인 Cyclin B1의 발현을 감소시켰고, p27의 발현을 증가시켰다. 이어서 세포사멸에 미치는 영향도 확인해 보기 위해 SK-MEL-5, SK-MEL-28 세포에 SCL-EtOH를 다양한 농도로 처리하고 Annexin V Alexa Fluor™ 488/Propidium Iodide로 염색을 시행한 다음 flow cytometry 분석을 통해 확인한 결과, SCL-EtOH가 apoptosis를 유도하였고 western blot에서도 관련 마커 인 cleaved-caspase-7의 발현을 증가시켰다. 마지막으로 western blot 분석을 통해 염증 지표 단백질인 COX-2의 발현을 확인한 결과, SCL-EtOH에 의해 농도 의존적 으로 발현이 감소하였다. 키워드: Skin cancer; Melanoma; Smilax china L. extracts; Anticancer
more초록/요약
The incidence and mortality rates of skin cancer are continuously increasing. Excisional surgery, radiation therapy and drug treatment are being performed, but due to patients' resistance to surgery and the side effects of drug and radiation treatment, relatively safe herbal medicine are being widely studied. Therefore, we aimed to study the effect of Smilax China L.(SCL), which has anti-inflammatory, antioxidant, and anticancer effects, on the growth of skin cancer cells. HaCaT cells, a normal human cell line, and skin cancer cells including A431, SK-MEL-5 and SK-MEL-28 cells were treated with Smilax China L. ethanol extract(SCL-EtOH) at concentrations of 5, 10, 20 and 40 ㎍/㎖. As a result, it showed no toxicity to HaCaT cells up to the highest concentration of 40 ㎍/㎖, and significant cell growth inhibition to A431, SK-MEL-5 and SK-MEL-28 cells in a time- and concentration-dependent manner. In addition, as a result of checking the shape of skin cancer cells according to SCL-EtOH treatment, it was observed that as the concentration increased, the number of normally attached and growing cells decreased and the shape of the cells changed. Meanwhile, JB6 Cl41, a normal mouse epithelial cell line, was treated with epidermal growth factor(EGF) and phorbol 12-myristate 13-acetate(TPA), an inflammatory factor, to induce cell transformation and treated with SCL-EtOH. An anchorage-independent cell growth experiment was performed to confirm the inhibitory effect of cell transformation. As a result, colony formation was significantly reduced in a concentration-dependent manner in JB6 Cl41 cells treated with EGF or TPA. In addition, we treated SK-MEL-5 and SK-MEL-28 cells with SCL-EtOH at various concentrations and checked the effect on the cell cycle. Flow cytometry analysis with propidium iodide(PI) staining showed that SCL-EtOH induced the G2/M phase arrest. We further confirmed the decrease in Cyclin B1 expression and increase in p27 expression associated with the G2/M phase of the cell cycle through western blot analysis. Next, to check the effect of SCL-EtOH on apoptosis, SK-MEL-5 and SK-MEL-28 cells were treated with SCL-EtOH at various concentrations, stained with Annexin V Alexa Fluor™ 488/Propidium Iodide. Flow cytometry analysis confirmed that SCL-EtOH induced cell apoptosis. Furthermore, through Western blot analysis, it was observed that the expression of cleaved-caspase-7, which is related to apoptosis, increased. Finally, it was confirmed that the expression of COX-2, an inflammatory marker protein, decreased in a concentration-dependent manner with SCL-EtOH. Through the above results, we have established a basis for applying SCL to the treatment of skin cancer. Keywords: Skin cancer; Melanoma; Smilax China L. extracts; Anticancer
more목차
그림 목차 ·ⅲ
표 목차 ⅳ
초록 ⅴ
Ⅰ. 서론 · 1
Ⅱ. 재료 및 방법 2
1. 재료 2
1) 시료 2
2) 시약 및 기구 3
2. 실험방법 4
1) 세포배양 ·4
2) 정상 세포에 대한 독성 측정 4
3) 피부암 세포의 생존율 측정 5
4) 세포 형태 변화 관찰 5
5) Anchorage-independent cell growth 분석(Soft Agar assay) 5
6) Propidium Iodide (PI) 염색을 통한 세포주기 분석 6
7) Annexin V/PI 염색을 통한 세포 사멸 분석 ·7
8) Western blot을 통한 단백질 발현 분석 7
9) 통계처리 ·8
Ⅲ. 실험결과 ·9
1. 정상세포에 대한 독성 여부 9
2. 다양한 피부암 세포주의 성장에 미치는 영향 ·11
1) 비흑색종 세포주에서의 세포 성장 저해 효과 11
2) 흑색종 세포주에서의 세포 성장 저해 효과 11
3. 피부암 세포 형태에 미치는 영향 18
4. Anchorage-independent cell growth 분석을 이용한 colony 형성 억제에 미치
는 영향 19
1) EGF에 의해 유도된 세포변형에서의 억제 효과 ·19
2) TPA에 의해 유도된 세포변형에서의 억제 효과 19
5. 세포주기 조절에 미치는 영향 23
1) Flow cymetry를 통한 세포주기 조절에 미치는 영향 23
2) 세포주기 조절 단백질에 미치는 영향 ·23
6. 세포사멸 유도에 미치는 영향 28
1) Flow cymetry를 통한 세포사멸 유도에 미치는 영향 28
2) 세포사멸 유도 단백질에 미치는 영향 ·28
7. COX-2 단백질 발현 억제에 미치는 영향 ·33
Ⅳ. 고찰 ·34
Ⅴ. 결론 ·39
참고문헌 40
ABSTRACT 44